La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. una de las características más atractivas de los métodos de fluorescencia es su sensibilidad inherente, la cual es , con frecuencia, de uno a tres ordenes de magnitud mejor que las de la Espectroscopía de absorción. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los métodos de absorción debido al número relativamente limitado de sistemas químicos que se pueden hacer fluorescer
Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque hay diversas formas en las cuales un átomo o una molécula excitada liberan su exceso de energía y se relajan a su estado fundamental. Dos de las más importantes de estos mecanismos son la relajación (desactivación) no radiante y la relajación fluorescente.
VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA
1.- Rendimiento cuántico: El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia es simplemente las relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al número total de moléculas excitadas. Las moléculas altamente fluorescentes, por ejemplo, la fluoresceina, tienen eficiencias cuánticas que, en ciertas condiciones, se aproximan a la unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prácticamente cero.
2.- Estructura: La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos. Los compuestos que contienen estructuras alifáticas y alicíclicas de carbonilo o estructuras con dobles enlaces muy conjugados pueden presentar también fluorescencia. La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución, la eficacia cuántica aumenta con el número de anillos y con su grado de conjugación. La sustitución en un anillo aromático causa desplazamientos en la longitud de onda de absorción máxima y los cambios correspondientes en los picos de fluorescencia. Además, la sustitución afecta frecuentemente la eficiencia de la fluorescencia.
3.- Rigidez estructural: Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está particularmente favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas. Por ejemplo, las eficacias cuánticas para el fluoreno y el bifenilo están próximas a 1'0 y 0'2, respectivamente, bajo condiciones similares de medida. La influencia de la rigidez también tiene importancia en el aumento de la fluorescencia de ciertos quelatantes orgánicos cuando están formando un complejo con un ion metálico.
4.- Temperatura y disolvente: La eficacia cuántica de la fluorescencia disminuye en muchas moléculas con el aumento de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia de las colisiones a temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivación no radiante ( conversión externa ). Una disminución en la viscosidad del disolvente también aumenta la probabilidad de conversión externa y produce el mismo resultado.
5.- Efecto del pH: La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisión son probablemente diferentes para la forma ionizada y no ionizada del compuesto. Por lo tanto será muy frecuente en los métodos fluorimétricos el control estricto del pH.
6.- Efecto de la concentración: La potencia de la radiación fluorescente es proporcional a la potencia radiante del haz de excitación que es absorbido por el sistema.
Edimburgh Instruments FLS980
Se trata de un Espectrómetro modular para la medida de técnicas combinadas en fluorescencia de estado estacionario, tiempos de vida de fluorescencias y de fosforescencias con medida de tiempos de vida de Fluorescencia por TCSPC en todo el rango.
Fuentes de Energía:
- Fuentes de EXCITACIÓN:
> Lámpara de Xenon de 350 W de potencia de emisión continua con fuente de alimentación
> Lámpara de Xenon pulsada de alta energía de 60 W de potencia media
- Fuentes PULSADAS:
> Láseres pulsados de diodo de picosegundos: 366-380 nm, 398-410 nm, 437-446 nm, 470-478 nm, 505-515 nm y 635 nm
> Láseres de diodo pulsados de granpotencia para up-conversion: 790-850 nm (808 nm de 2W) y 950-1000 nm (980 nm de 20W).
> EPLED 250, EPLED 265 y EPLED 280 nm
Detectores fotomultiplicadores:
- de Ultravioleta-visible refrigerado mediante efecto Peltier: 300-900 nm
- de Infrarojo cercano refrigerado por Nitrógeno Líquido: 30-1700 nm, con depósito y sifón de transferencia.
Cámara de muestra
Soporte para cubetas de líquidos y sólidos, polvos y films.
Termostatizados por efecto peltier sin necesidad de líuidos de recirculaciónexternos.
Se pueden consultar las características en la WEB de Edimburgh Instruments: Pulsa Aquí.
La espectrometría de fluorescencia se utiliza en análisis bioquímicos, médicos, químicos y de investigación de compuestos orgánicos.
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