Test rápido y asequible de COVID-19 basado en amplificación genética isotérmica y lectura visual

Test rápido y asequible de COVID-19 basado en amplificación genética isotérmica y lectura visual.

La enfermedad de COVID-19 es producida por un virus con material genético RNA llamado SARS-CoV-2. El estándar de oro de su detección es mediante amplificación genética con reacción en cadena de la polimerasa taq pol (PCR) previa retrotranscripción, RT-qPCR. Correctamente aplicada esta técnica es muy sensible y especifica. Puede detectar hasta menos de 10 copias de la diana genética. Sin embargo presenta varios inconvenientes que restringen su realización a laboratorios diagnósticos de tamaño mediano-grande. Necesita sucesión de ciclos térmicos repetidos bien controlados y lectura en tiempo real de fluorescencia de sondas genéticas. Igualmente es necesario un paso de purificación del material genético llamado extracción de RNA. Los equipos capaces de realizar estos procesos son caros 14 000-100 000 euros. Es imprescindible además personal técnico entrenado en su manejo y mantenimiento. Ello encarece las pruebas y limita su aplicación a entornos hospitalarios o medicina privada.

Nosotros somos un equipo de 5 microbiólogos del Hospital Universitario de Burgos. Estamos desarrollando un test diagnóstico genético que evite los inconvenientes de coste y accesibilidad. Está basado en la tecnología RT-LAMP. Este acrónimo significa retrotranscripción (RT) y amplificación isotérmica basada en bucles (LAMP). En esta metodología utilizamos una enzima DNA polimerasa diferente de la PCR habitual. Es la Bst polimerasa. Mediante oligonucleótidos convenientemente seleccionados es posible formar una estructura semejante a una mancuerna que es susceptible de amplificación genética exponencial. La reacción transcurre a temperatura constante de ente 60 y 65Cº. La técnica sintetiza una gran cantidad de DNA liberando como producto de deshecho grupos de pirofosfato. Este compuesto químico es ácido y disminuye el pH del medio de reacción. Dicho cambio es detectable mediante utilización indicadores de pH que cambian de color como el rojo fenol. La reacción positiva es fácilmente distinguible a ojo mediante cambio de color desde rosa magenta a amarillo. Esto evita la necesidad utilización de detectores por fluorescencia y termocicladores. Es posible así la detección genética específica simplemente utilizando el ojo y cualquier dispositivo que mantenga una temperatura constante. Por ejemplo un baño seco. 

Si, números:

4) Salud y bienestar. Una tecnología de detección rápida, asequible y aplicable en entornos de mínimos recursos revolucionara el manejo de la enfermedad.

8) trabajo y crecimiento económico

9) Industria innovación e infraestructura: Detección in situ de personal transmisor de la enfermedad de COVID-19 hará los entornos de trabajo más seguros. Posibilitará la utilización con menos riesgo de la infraestructura existente de fábricas y transporte.

La detección de material genético mediante RT-qPCR de SARS-CoV-2 es el estándar diagnóstico de enfermedad e transmisibilidad del COVID-19. Se necesita extracción de RNA, transcripción inversa, amplificación mediante ciclos térmicos y lectura de florescencia a tiempo real para realizar la prueba. Ello limita su realización a laboratorios medianos-grandes. Esta es la razón también del elevado coste de la prueba, 70-100 euros realizado por medicina privada.

La metodología RT-LAMP ofrece posibilidad de detección específica con sensibilidad y especificidad parecida a la RT-qPCR. Su capacidad de transcurrir a temperatura constate y detección visual posibilitan reducción radical del coste. En este momento manejamos coste inferior a 1 euro detección de diana génica en reactivos. Es posible aunque no muy explorada la amplificación sin extracción de RNA.

La prueba tiene escasa demanda técnica. Básicamente sirve cualquier dispositivo que mantenga temperatura constate de entre 60 y 65Cª. Eso posibilita expansión radical del entorno de aplicación, pudiendo realizarse en cualquier situación de demanda: colegios, universidades, hospitales pequeños, urgencias, consultas, fabricas, centros de trabajo...

Proyecto financiado por la gerencia de Sanidad de la Junta de Castilla y leon con 4200 euros. Nos hemos clasificado entre los 230 semifinalistas de la competición internacional XPRISE de pruebas diagnósticas de COVID. Esperamos el “profiency kit” de valoración de nuestra sensibilidad y especificidad. Nuestro equipo consta de 5 personas integrantes. Los 5 somos microbiólogos del Hospital Universitario de Burgos. Ahí hacemos los experimentos. Hay médicos y farmacéuticos. La situación actual es que el reactivo de amplificación y detección visual está funcionando bien. Capacidad de detección inferior a 10 copias de DNA sintético diana/reacción en 1h. Es decir bastante sensibilidad desde cDNA. Especificidad también buena, no hemos observado amplificaciones inespecíficas en menos 1h con los alrededor de 100 muestras analizadas. Tenemos dificultades en el paso de RNA a cDNA, la retrotranscripción. La sensibilidad con muestras clínicas por ello es aun baja. Se necesitan hacer más experimentos para optimización. Experimentos en amplificación sin extracción del RNA demuestran que es posible.

Buscamos gente para formar parte de nuestro equipo para ayudarnos a hacer los experimentos de optimización del reactivo principal. No necesaria experiencia previa en biología molecular. Te formaremos lo mejor que podemos. Hay que aprender a realizar experimentos de detección de material genético de COVID-19 mediante amplificación isotérmica. Aprender valoración crítica de dichos experimentos. Adquirir capacidad de resolución de problemas que surgen utilizando tu creatividad y comprensión.

Gente con experiencia en la industria farmacéutica, aspectos legales y empresariales tampoco vendrá mal pero más adelante. En primer lugar debemos mejorar nuestro reactivo y necesitamos personas que nos echen una o varias manos con los experimentos.

En general si tienes interés en el proyecto y quieres contribuir o aprender llámanos. Probablemente ni siquiera nos imaginamos que podría sernos útil. Veremos lo que podemos hacer.

COVID-19, test, RT-PCR, RT-LAMP, detección colorimétrica.